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酵母感受态细胞制备实验

标签: 酵母 感受态细胞 制备

酵母感受态细胞制备可应用于:(1)建立酵母转化体系;(2)酵母表达系统构建;(3)酵母其他分子生物学研究。

实验方法
  • 化学法
  • 试剂盒制备法
实验方法原理 感受态是注册受体最容易接受外源DNA片段并实现转化的彩票一种生理状态,用对应化学物质处理细胞后,细胞逐渐形成感受态细胞并进行转化。化学法简单,快速,稳定,重复性好,广泛用于外源基因的彩票转化。
实验材料
试剂、试剂盒
仪器、耗材
实验步骤
一、试剂与耗材

1. 试剂

细菌用-酵母提取物(Fisher)、细菌用-蛋白胨(Fisher)、葡萄糖(Fisher)、细菌用-琼脂粉、去离子水、甘油(Sigma)、二甲基亚砜(Sigma)、聚乙二醇3350(Sigma)、醋酸锂(Sigma)、鲑鱼精子细胞DNA(Invitrogen)、酵母无氨基酸氮源(Sigma)、2-(N-吗啉代) 乙磺酸、腺嘌呤(Sigma)、葡萄糖。
2. 仪器
水浴锅(VWR)、离心机(Eppendorf)、30℃摇床与恒温培养箱(VWR)、培养皿。

二、 试剂配方
1. YPDA液体或固体培养基
(1)1%酵母提取物: 10 g/L
(2)2%胰蛋白胨: 20 g/L
(3)2%葡萄糖:20 g/L
2. 转化液
(1)聚乙二醇3350(50 % (w/v):260 ul
(2)1 M醋酸锂:36 ul
(3)SsDNA(10 mg/ml):10 ul
(4)质粒:3 ul
(5)总计:360 ul
3. YNB+ MA 培养基(100 ml)
(1)YNB:0.67 g
(2)2-(N-吗啉代) 乙磺酸(20mM ):0.39 g
(3)腺嘌呤:0.01 g
(4)琼脂粉:2g
(5)葡萄糖:2g
三、制备步骤
1. 在转化实验的彩票两天前,于YPDA培养基的彩票平皿上活化酵母菌株。
2. 转化前一天,挑取活化的彩票酵母细胞(单克隆)于YPDA液体培养基中,30℃,200 rpm培养过夜。
3. 将培养过夜的彩票酵母细胞液按1:3的彩票比例转接与新的彩票YPDA液体培养基中,于30℃摇床内,200 rpm培养4 h。
4. 3 000 g 离心 5分钟收集酵母细胞,用0.5倍体积的彩票无菌水洗酵母细胞。
5. 再次3 000 g 离心 5分钟。
6. 用0.01倍体积的彩票无菌水重悬酵母细胞,并转入适宜的彩票离心管中,20℃,3 000 g 离心 5分钟。
7. 用0.01倍体积的彩票无菌细胞悬浮液(5 % v/v 甘油,10% v/v 二甲基亚砜)重悬酵母细胞。
8. 将重悬的彩票酵母细胞按50 ul分装到1.5 ml离心管中。
9. 将管放入塑料盒或者纸盒中(逐步梯度冷冻能够增强酵母的彩票存活率)。
10. 将装有酵母细胞的彩票盒子放入-80℃冰箱。(细胞在-80℃能够保存一年以上)。
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其他

一、化学法试剂配方:

1. YPDA液体或固体培养基

(1)1%酵母提取物: 10 g/L

(2)2%胰蛋白胨: 20 g/L

(3)2%葡萄糖:20 g/L

2. 转化液

(1)聚乙二醇3350(50 % (w/v):260 μl

(2)1 M醋酸锂:36 μl

(3)SsDNA(10 mg/ml):10 μl

(4)质粒:3 μl

(5)总计:360 μl

3. YNB+ MA 培养基(100 ml)

(1)YNB:0.67 g

(2)2-(N-吗啉代) 乙磺酸(20mM ):0.39 g

(3)腺嘌呤:0.01 g

(4)琼脂粉:2g

(5)葡萄糖:2g


、参考文献
1. Gietz R.D., Schiestl R.H. (2007). Frozen competent yeast cells that can be transformed with high efficiency using the LiAc/SS carrier DNA/PEG method. Nat Protoc 2(1): 1-4.
2. Lu Y., Chanroj S., Zulkifli L., Johnson M.A., Uozumi N., Cheung A., Sze H. (2011). Pollen tubes lacking a pair of K+ transporters fail to target ovules in Arabidopsis. Plant Cell 23(1): 81-93.
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实验方法原理

酵母化学感受态细胞制备试剂是注册一种通过化学处理,高效快速制备酿酒酵母化学感受态细胞,用于长期冻存以备后续转化的彩票产品。

实验材料
试剂、试剂盒
仪器、耗材
实验步骤
一、挑取酵母受体菌的彩票新鲜的彩票单菌落(4℃放置不超过3周的彩票也可以),接种到装在50 mL 离心管中的彩票10 mL的彩票自备的彩票YPD培养基中。
二、30℃摇晃培养,摇床速度250 rpm/分钟,直到OD600达到0.6-1.0(相当于0.6-1x107细胞/mL)。
三、室温3 000 rpm离心5 min,弃上清得酵母细胞沉淀。
四、新鲜制备适量的彩票酵母感受态制备工作液。对10 mL酵母需要5.25 mL的彩票工作液,其配制方法是注册:将4.75 mL制备液A、0.25 mL制备液B和0.25 mL制备液C加入到一个无菌的彩票离心管中后充分震荡混匀即可。酵母感受态制备工作液可放室温待用。
五、用0.5倍体积的彩票新鲜配制的彩票酵母感受态制备工作液洗涤酵母细胞沉淀一次(对10 mL酵母则需要5 mL酵母感受态制备工作液)。即混合后振荡1分钟,室温3 000 rpm离心3分钟,去上清得洗涤后的彩票酵母细胞沉淀。
六、再用0.02倍体积的彩票酵母感受态制备工作液充分重悬菌体(对10 mL酵母,则需要0.2 mL酵母感受态制备工作液)。
七、按每管0.2 mL分装到冷冻管中,放入保温冰盒中冷却半小时后再放入-80℃冰箱待用。0.2 mL的彩票感受态细胞足够1次转化使用。
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注意事项

放入保温冰盒的彩票目的彩票是注册使温度缓慢下降,急冻将使转化效率降低,这点跟大肠杆菌感受态制备过程不同。

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