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PCR扩增产物的彩票克隆

标签: PCR 扩增 克隆

PCR扩增产物的彩票克隆可以:(1)获得目的彩票DNA片段;(2)用于原核表达的彩票研究;(3)广泛应用于分子生物学相关研究。

详细
实验方法
  • 平端连接法
  • TA克隆法
实验方法原理
平头连接是注册将制备好的彩票平头载体和补平或削平的彩票PCR产物直接进行连接。载体可用EcoR V或Sma I切成平头;PCR产物纯化后,可以在22℃用DNA聚合酶I作用30min(利用该酶所具有的彩票3'→5'外切酶活性和5'→3'的彩票聚合酶活性)。

如果要求不高,PCR产物也可不加处理。如果使用Stratagene公司的彩票pfu DNA聚合酶或New England Biolabs公司的彩票Vent DNA聚合酶,这两种酶有5'→3'校对能力,扩增出来的彩票PCR产物已经是注册平头,可以不作平端处理。平端连接的彩票一个显而易见的彩票缺陷是注册连接效率低下,即使使用很高单位的彩票连接酶,或在反应体系中加入PEG 8000,也只能很有限地提高效率。

通常情况下,PCR产物可直接与平端载体DNA进行连接,但其连接效率效低。因为Taq DNA聚合酶具有非模板依赖性末端转移酶活性,能在两6条 DNA链的彩票3'末端加上一个多余的彩票碱基,使合成的彩票PCR产物成为3'突出一个碱基的彩票DNA分子。

这种DNA分子的彩票连接效率很低。由于PCR产物的彩票效率通过较高,在采用大量T4 DNA连接酶并配以5-10u T4 RNA连接酶时,可显著提高其连接效率。

对于较短PCR产物,用PUS19的彩票HincⅡ位点进行克隆,以X-gal和IPTG筛选,常可得到足量重组子。另一种提高克隆效率的彩票途径是注册先用Klenow大片段或T4DNA聚合酶消去3'末端突出碱基将PCR产物变成平端DNA,然后再用平端连接法克隆PCR产物。
实验材料
试剂、试剂盒
仪器、耗材
实验步骤
一、PCR反应
1. 依次混匀下列试剂
(1)H2O:35 ul
(2)10×PCR反应缓冲液:5ul
(3)25 mmol/L MgCl2:4ul
(4) 4种dNTP:4ul
(5)上游引物(引物1):0.5ul
(6)下游引物(引物2):0.5ul

(7)模板DNA(约1 ng):0.5ul
(8)混匀后离心5秒。
2. 将混合物在94℃下加热5分钟后冰冷,迅速离心数秒, 使管壁上液滴沉至管底,加入Taq DNA聚合酶(0.5 ul 约2.5 U),混匀后稍离心,加入一滴矿物油覆盖于反应混合物上。
3. 用94℃变性1分钟,45℃退火1分钟, 72℃延伸2分钟, 循环35轮,进行PCR。最后一轮循环结束后, 于72℃下保温10分钟,使反应产物扩增充分。
二、电泳
取10 ul 扩增产物用1%琼脂糖凝胶进行电泳分析,检查反应产物及长度。
三、PCR产物的彩票纯化
扩增的彩票PCR产物如利用T-Vector进行克隆,可直接使用,如用平未端或粘性未端连接,往往需要将产物纯化。
1. 酚/氯仿法
(1)取反应产物加100 ul TE。
(2)加等体积氯仿混匀后用微型离心机10000 rpm离心15秒,用移液器将上层水相吸至新的彩票小管中。这样抽提一次, 可除去覆盖在表面的彩票矿物油。
(3)再用酚:氯仿:异戊醇抽提二次,每次回收上层水相。
(4)在水相中加300 ul 95%乙醇,置-20℃下30 min沉淀。
(5)在小离心机上10000 rpm离心10 min,吸净上清液。加入1 ml 70%乙醇,稍离后,吸净上清液.重复洗涤沉淀2次。将沉淀溶于7 ml ddH2O 中,待用。

2. Wizard PCR DNA纯化系统
Wizard PCR DNA纯化系统可以快速、有效、可靠地提取PCR扩增液中的彩票DNA,提纯后的彩票DNA可用于测序、标记、克隆等。 该系统中含有的彩票试剂和柱子可供50次PCR产物的彩票纯化,试剂包括:50 ml Wizard PCR DNA纯化树脂、5 ml 直接提取缓冲液、50支 Wizard微型柱。
(1)吸取PCR反应液水相放于1.5 ml eppendorf管中。
(2)加100 ml直接提取缓冲液,涡旋混匀。
(3)加1 ml PCR DNA纯化树脂,1分钟内涡旋混合3次。
(4)取一次性注射器, 取出注塞,并使注射筒与Wizard微型柱连接,用移液枪将上述混合液加入注射筒中,并用注塞轻推,使混合物进入微型柱。
(5)将注射器与微型柱分开,取出注塞, 再将注射筒与微型柱相连,加入2 ml 80%异丙醇,对微型柱进行清洗。
(6)取出微型柱置于eppendorf管中,12 000 g离心20秒,以除去微型柱中的彩票洗液。
(7)将微型柱放在一个新eppendorf管中,加50 ul TE或水,静止1分钟后,12 000 g离心20秒。
(8)丢弃微型柱,eppendorf管中的彩票溶液即为纯化DNA,存放于4℃或-20℃。
四、载体加dT尾
1. 将1 ug pUC19用SmaⅠ全酶切。
2. 在小管中按上述PCR反应,加入各种混合物,除将4 ul 4种dNTP改为4 ul 25 mM dTTP。
3. 加入1 ul(5U)的彩票Taq DNA聚合酶在72℃下加热2 h。
4. 按前面三中所述,用酚:氯仿:异戊醇抽提二次。
5. 加入2倍体积 95%乙醇,在-20℃下沉淀1 h。
6、离心,用70%乙醇漂洗后,真空抽干,溶于10ml ddH2O中。
五、PCR产物与载体粘末端连接
1. 在7 ml PCR产物中加1 ml带dT尾的彩票pUC质粒。
2. 加1 ml T4DNA连接酶,1 ml 10×连接缓中液,混匀,16℃连接过夜。
3. 取5 ml连接产物转化感受态细胞并筛选重组子。
六、PCR产物3'突出端切平及平末端连接
1. 在50 ml的彩票PCR产物中,直接加0.5 ml T4 DNA聚合酶混匀。
2. 37℃反应10分钟后,70℃灭活10分钟。
3. 用酚:氯仿抽提2次。
4. 乙醇沉淀。沉淀用70%乙醇漂洗后,真空抽干,溶于7 ml ddH2O中。
5. 质粒用Smal 切开后,70℃ 15分钟灭活酶,取1 ml (约0.1 mg)加入上述PCR产物中。加T4 DNA连接酶1 ml ,连接缓冲液1 ml 。
6. 取5 ml 连接产物转化感受态细胞并筛选重组子。
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注意事项
1. PCR反应液可直接用于连接,但最好对PCR产物纯化后进行连接,既能去掉dNTP与ATP竞争连接酶又能浓缩PCR产物。

2. PCR非常灵敏, 操作应尽可能在无菌操作台中进行。
3. 吸头、离心管应高压灭菌, 每次吸头用毕应更换, 不要互相污染试剂。
4. 加试剂前, 应短促离心10秒钟, 然后再打开管盖, 以防手套污染试剂及管壁上的彩票试剂污染吸头侧面。
5. 应设含除模板DNA所有其它成分的彩票负对照。
6. 纯化树脂在使用前必须充分混匀。
7. PCR产物中矿物油应尽量吸去,否则会娱乐影响提取DNA的彩票 产量。
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其他
一、 PCR反应中的彩票主要成份

1. 引物
PCR反应产物的彩票特异性由一对上下游引物所决定。引物的彩票好坏往往是注册PCR成败的彩票关键。引物设计和选择目的彩票DNA序列区域时可遵循下列原则:

(1) 引物长度约为16-30 bp, 太短会娱乐降低退火温度影响引物与模板配对,从而使非特异性增高。太长则比较浪费,且难以合成。

(2)引物中G+C含量通常为40%-60%,可按下式粗略估计引物的彩票解链温度 Tm=4(G+C)+2(A+T)。

(3)四种碱基应随机分布,在3'端不存在连续3个G或C,因这样易导致错误引发。

(4)引物3'端最好与目的彩票序列阅读框架中密码子第一或第二位核苷酸对应, 以减少由于密码子摆动产生的彩票不配对。

(5)在引物内, 尤其在3'端应不存在二级结构。

(6)两引物之间尤其在3'端不能互补, 以防出现引物二聚体, 减少产量。两引物间最好不存在4个连续碱基的彩票同源性或互补性。

(7)引物5'端对扩增特异性影响不大, 可在引物设计时加上限制酶位点、核糖 体结合位点、起始密码子、缺失或插入突变位点以及标记生物素、荧光素、地高辛等。通常应在5'端限制酶位点外再加1-2个保护碱基。

(8)引物不与模板结合位点以外的彩票序列互补。所扩增产物本身无稳定的彩票二级结构, 以免产生非特异性扩增,影响产量。

(9)简并引物应选用简并程度低的彩票密码子, 例如选用只有一种密码子的彩票Met, 3'端应不存在简并性。否则可能由于产量低而看不见扩增产物。
(10)一般PCR反应中的彩票引物终浓度为0.2-1.0 umol/L。引物过多会娱乐产生错误引导或产生引物二聚体, 过低则降低产量。利用紫外分光光度计, 可精确计算引物浓度, 在1cm光程比色杯中,260nm下,引物浓度可按下式计算:
X mol/L= OD260/ A(16000)+C(70000)+G(12000)+T(9600)
X: 引物摩尔浓度,A、C、G、T:引物中4种不同碱基个数。
2. 4种三磷酸脱氧核苷酸(dNTP)

(1)dNTP应用NaOH 将pH调至7.0,并用分光光度计测定其准确浓度。

(2)dNTP原液可配成5-10 mmol/L并分装,-20℃贮存。一般反应中每种dNTP的彩票终浓度为20-200 umol/L。

(3)理论上4 种 dNTP各20 umol/L,足以在100 ul 反应中合成2.6 ug的彩票DNA。当dNTP终浓度大于50 mmol/L时可抑制Taq DNA聚合酶的彩票活性。4种dNTP的彩票浓度应该相等,以减少合成中由于某种dNTP的彩票不足出现的彩票错误掺入。
3. Mg2+

(1)Mg2+浓度对Taq DNA聚合酶影响很大,它可影响酶的彩票活性和真实性,影响引物退火和解链温度, 影响产物的彩票特异性以及引物二聚体的彩票形成等。

(2)通常Mg2+ 浓度范围为0.5-2 mmol/L.对于一种新的彩票PCR反应,可以用0.1-5 mmol/L的彩票递增浓度的彩票Mg2+ 进行预备实验,选出最适的彩票Mg2+浓度。

(3)在PCR反应混合物中, 应尽量减少有高浓度的彩票带负电荷的彩票基团, 例如磷酸基团或EDTA等可能影响Mg2+ 离子浓度的彩票物质,以保证最适Mg2+ 浓度。
4. 模板

(1)PCR反应必须以DNA为模板进行扩增, 模板DNA可以是注册单链分子,也可以是注册双链分子,可以是注册线状分子,也可以是注册环状分子(线状分子比环状分子的彩票扩增效果稍好)。

(2)就模板DNA而言,影响PCR的彩票主要因素是注册模板的彩票数量和纯度.一般反应中的彩票模板数量为102 -105 个拷贝,对于单拷贝基因,这需要0.1 ug的彩票人基因组DNA,10ng的彩票酵母DNA,1ng的彩票大肠杆菌DNA.扩增多拷贝序列时,用量更少。

(3)灵敏的彩票PCR可从一个细胞,一根头发,一个孢子或一个精子提取的彩票DNA中分析目的彩票序列。

(4)模板量过多则可能增加非特异性产物。DNA中的彩票杂质也会娱乐影响PCR的彩票效率。
5. Taq DNA聚合酶

一般Taq DNA聚合酶活性半衰期为92.5℃ 130 min,95℃ 40 min, 97℃ 5 min。现在人们又发现许多新的彩票耐热的彩票DNA聚合酶,这些酶的彩票活性在高温下活性可维持更长时间。

Taq DNA聚合酶的彩票酶活性单位定义为74℃下,30 min,掺入10 nmol/L dNTP到核酸中所需的彩票酶量。Taq DNA聚合酶的彩票一个致命弱点是注册它的彩票出错率,一般PCR中出错率为2x 10-4 核苷酸/每轮循环,在利用PCR克隆和进行序列分析时尤应注意.在100 ul PCR反应中,1.5-2单位的彩票Taq DNA聚合酶就足以进行30轮循环。

所用的彩票酶量可根据DNA、引物及其它因素的彩票变化进行适当的彩票增减.酶量过多会娱乐使产物非特异性增加,过少则使产量降低。

反应结束后,如果需要利用这些产物进行下一步实验,需要预先灭活Taq DNA聚合酶, 灭活Taq DNA聚合酶的彩票方法有:

(1)PCR产物经酚:氯仿抽提,乙醇沉淀。

(2)加入10 mmol/L的彩票EDTA螯合Mg2+

(3) 99-100℃加热10 min。目前已有直接纯化PCR产物的彩票Kit可用。
6. 反应缓冲液

(1)反应缓冲液一般含10-50 mmol/L Tris·Cl (20℃下pH8.3-8.8), 50 mmol/L KCl和适当浓度的彩票Mg2+ 。Tris·Cl在20℃时pH为8.3-8.8,但在实际PCR反应中,pH为6.8-7.8. 50 mmol/L的彩票KCl有利于引物的彩票退火。

(2)反应液可加入5mmol/L的彩票二硫苏糖醇(DDT)或100 ug/ml的彩票牛血清白蛋白(BSA),它们可稳定酶活性,另外加入T4噬菌体的彩票基因32蛋白则对扩增较长的彩票DNA片段有利。

(3)各种Taq DNA聚合酶商品都有自己特定的彩票一些缓冲液。
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实验方法原理 TA克隆 系统由Invitrogen公司(San Diego,CA)发展而来的彩票商业性试剂盒,它用于PCR 产物的彩票克隆 和测序。其原理是注册利用Taq酶能够在PCR 产物的彩票3'末端加上一个非模板依赖的彩票A,而T载体是注册一种带有3'T突出端的彩票载体,在连接酶作用下,可以快速地、一步到位地把PCR 产物直接插入到质粒载体的彩票多克隆 位点(MCS)中。

外源DNA与载体分子的彩票连接就是注册DNA重组,这样重新组合的彩票DNA叫做重组体或重组子。重组的彩票DNA分子是注册在DNA连接酶的彩票作用下,有Mg2+、ATP存在的彩票连接缓冲系统中,将分别经酶切的彩票载体分子与外源DNA分子进行连接。DNA连接酶有两种:T4噬菌体DNA连接酶和大肠杆菌DNA连接酶。两种DNA连接酶都有将两个带有相同粘性末端的彩票DNA分子连在一起的彩票功能,而且T4噬菌体DNA连接酶还有一种大肠杆菌DNA连接酶没有的彩票特性,即能使两个平末端的彩票双链DNA分子连接起来。但这种连接的彩票效率比粘性末端的彩票连接率低,一般可通过提高T4噬菌体DNA连接酶浓度或增加DNA浓度来提高平末端的彩票连接效率。

T4噬菌体DNA 连接酶催化DNA 连接反应分为3 步:首先,T4 DNA 连接酶与辅因子ATP形成酶-ATP复合物;然后,酶-ATP复合物再结合到具有5'磷酸基和3'羟基切口的彩票DNA上,使DNA腺苷化;最后产生一个新的彩票磷酸二酯键,把切口封起来。连接反应通常将两个不同大小的彩票片断相连。因为DNA片断有两个端点,所以切割时出现两种可能,一种是注册单酶切,另一种是注册双酶切,这两种酶切方法在基因工程操作中都经常用到。对于单酶切来说,载体与供体的彩票末端都相同,连接可以在任何末端之间进行,这样就导致彩金大量的彩票自连接产物。为彩金减少自环的彩票高本底,可对载体进行5'除磷酸处理,原理是注册连接酶只能连接DNA片断的彩票3'OH末端与5'端,所以除磷后载体不会娱乐自环。一旦有外源片断插入时,由外源片断提供5'端就能与载体进行连接。通过这种方法可大大减少由载体的彩票自环造成的彩票高本底。对于双酶切来说,无论载体与供体同一片段上都有不同的彩票末端,这样就避免彩金载体与供体的彩票自环,能使有效连接产物大大增加。双酶切的彩票另一个特点是注册能将供体分子定向连接到载体上。
连接反应的彩票温度在37℃时有利于连接酶的彩票活性。但是注册在这个温度下粘末端的彩票氢键结合是注册不稳定的彩票。因此采取折中的彩票温度,即12-16℃,连接12-16h(过夜),这样既可最大限度地发挥连接酶的彩票活性,又兼顾到短暂配对结构的彩票稳定。Taq DNA酶扩增的彩票PCR产物,其DNA双链前后末端都有一个游离的彩票A碱基,可以与pGEM-T Easy Vector 末端游离的彩票T碱基互补形成环状重组T质粒。
实验材料
试剂、试剂盒
仪器、耗材
实验步骤
1. 取大肠杆菌JM109保存液50 ul,接种于4 ml LB(或SOB)液体培养基中,37℃,300 rpm振荡培养过夜,第二天取50 ul 转接到新的彩票4 ml LB(或SOB)液体培养基中扩大培养3 h至OD600=0.35~0.4,在无菌操作台上取1 ml菌液于1.5 ml离心管中,冰浴10 min。
2. 4℃,5 000 rpm离心2 min,去上清液。
3. 加入750 ul预冷的彩票0.1 M CaCl2重悬菌体,冰浴30 min。
4. 4℃,5 000 rpm离心2 min,弃上清液。
5. 加入100 ul 冰冷的彩票0.1 M CaCl2轻轻重悬菌体,冰浴2 h后,4℃保存备用。
1. 将含Amp、X-Gal、IPTG的彩票LB平板37℃预热。
2. 于100 ul感受态细胞中加入10 ul连接产物,冰浴30 min。
3. 将离心管转入42℃水浴,热冲击90秒,然后不要摇动离心管,迅速将其放在冰上2 min。
4. 在离心管中加入SOC培养基300 ul,枪头混匀,37℃、150 rpm温和摇振60 min。
5. 将200 ul 转化菌液均匀地涂布于含50 mg/ml Amp、20 mg/ml X-gal、200 mg/ml IPTG 的彩票LB平板上,37℃倒置培养过夜,挑选白色菌落进行鉴定。
三、重组质粒的彩票鉴定
方案一: 菌落PCR
(1) 制备PCR混合液。
(2) 用经灭菌的彩票10 ul 枪头(不用牙签)挑去白色菌落,迅速地使挑取物溶在上述混合液中。
(3) 盖上离心管得盖子,在沸水上温育10 min。
(4) 将步骤 ⑶ 的彩票样品冷却至室温,离心数秒,然后于管中加入TaKaRa rTaq酶0.25 ul。
(5) 按以下条件进行PCR反应:94℃预变性3 min;然后进行30个循环反应,其温度循环条件为:94℃变性1 min,57℃退火1 min,72 ℃延伸1 min;循环结束后72℃再延伸5 min。
(6) 取5 ul PCR产物在1%琼脂糖凝胶上进行电泳检测。
方案二: 质粒PCR
1. 碱裂解法少量制备质粒DNA
(1)用离心管收集4 ml在LB培养基(含Amp)中培养过夜的彩票菌液,14 000 rpm离心30秒,弃尽上清。
(2)用250 ul 已加入RNase A1的彩票Buffer S1充分悬浮细菌沉淀。
(3)加入250 ul Buffer S2,温和但充分地上下翻转混合4-6次,此步骤不宜超过5 min。*Buffer S2使用后应立即盖紧瓶盖,以免空气中的彩票CO2中和Buffer S2中的彩票NaOH,降低溶菌效率。
(4)加入400 ul Buffer S3,温和地上下翻转8-10次,室温静置2 min,14 000 rpm离心10 min。
*若离心后凝结块未沉淀到离心管底部,应再上下翻转数次,12000g离心3min。
(5)将DNA-prep Tube置于2-ml Microfuge Tube中,将步⑷中的彩票混合液移入DNA-prep Tube中,5 500 rpm离心1 min。
(6) 弃滤液,将DNA-prep Tube置回到原2 ml Microfuge Tube中,加入500 ul Buffer W1,5500 rpm离心1 min。
(7)弃滤液,将DNA-prep Tube置回到原2 ml Microfuge Tube中,加入700 ul 已加无水乙醇的彩票Buffer W2,5 500 rpm离心1 min,以同样的彩票方法再用700 ul已加无水乙醇的彩票BufferW2洗涤一次。
(8) 弃滤液,将DNA-prep Tube置回到原2 ml Microfuge Tube中,14 000 rpm离心1 min。
(9)连滤液一并弃掉收集管,将DNA-prep Tube 置于一新的彩票1.5 ml 离心管中,在silica 膜中央加入25-30 ul Eluent或去离子水。
(10)室温静置2 min,14 000 rpm离心1 min洗脱DNA。
(11) 取5 uL样品,1%琼脂糖凝胶电泳初步筛选重组转化子。
2. 抽提纯化质粒DNA酚、氯仿抽提可以去除碱裂解法制备的彩票质粒DNA中残留的彩票蛋白质。
(1) 加TE稀释质粒DNA溶液至300 uL。
(2)加等体积的彩票酚:氯仿:异戊醇(25:24:1),震荡混匀,静置3 min。
(3)14 000 rpm 离心5 min,吸上清液,加等体积的彩票酚:氯仿:异戊醇(25:24:1),混匀,静置3 min。
(4) 14 000 rpm离心5 min,吸上清液,加等体积的彩票氯仿:异戊醇(24:1),混匀,静置3 min。
(5) 14 000rpm离心5 min,吸上清液,加2.5倍体积预冷的彩票无水乙醇,混匀后-20℃放置15 min,沉淀质粒DNA。
(6) 14 000rpm离心13 min,弃上清液,沉淀加入200 uL 70%乙醇洗涤一次,室温干燥,用20 uL去离子双蒸水溶解质粒DNA沉淀,-20℃保存待用。
(7) 取5 ul样品,1%琼脂糖凝胶电泳检测纯化结果。
3. 质粒PCR
(1) PCR反应体系如下:
(2)PCR 扩增反应条件:94℃预变性3 min;然后进行30 个循环反应,其温度循环条件为:
94℃变性1 min,57℃退火1 min,72 ℃延伸1 min;循环结束后72℃再延伸5 min。
(3) 取5 ul PCR产物于1%琼脂糖凝胶进行电泳检测,方法与试验二相同。
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注意事项
1. 要获得目的彩票基因的彩票TA克隆 ,PCR 产物的彩票特异性要好。
2. PCR 产物在TA克隆 前要通过纯化。
3. 在PCR 产物回收、纯化过程中防止外来DNA污染。
4. 制备感受态细胞的彩票全部操作均须于冰浴操作,同时注意近火无菌操作,防止感受态细胞受杂菌污染。
5. 42℃热处理时很关键,转移速度要快,且温度要准确。
6. 菌液涂皿操作时,应避免反复来回涂布,因为感受态细菌的彩票细胞壁有彩金变化,过多的彩票机械挤压涂布会娱乐使细胞破裂,影响转化率。

8. Ligation Solution I 请于冰中融解。
9. 在进行克隆时,Vector DNA和Insert DNA的彩票摩尔比一般为:1: 2 ~ 10。在本制品中, pMD18-T Vector1 ml (50 ng) 的彩票摩尔数约为0.03 pmol,Control Insert DNA 1ml (50 ng) 的彩票摩尔数约为0.15 pmol。
10. 克隆时使用的彩票Insert DNA片段 (PCR 产物) 尽量进行切胶回收纯化,PCR产物中的彩票短片段DNA(甚至是注册电泳也无法确认的彩票非特异性小片段)、残存引物等杂质都会娱乐影响TA克隆的彩票效率。
11. 按照本实验操作进行连接后,直接进行转化时的彩票连接液不要超过20 ml。当进行转化的彩票DNA用量较大或准备进行电转化时,需对连接液进行乙醇沉淀,纯化DNA后再进行转化。
12. 连接反应请在16℃下进行,温度升高 (>26℃) 较难形成环状DNA。
13. 连接效率偏低时,可适当延长连接时间至数小时。
14. 感受态细胞可使用适合于pUC系列载体的彩票感受态细胞,如:JM109,DH5a等。
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其他
一、常见问题

1. 怎样提高pMD18-T Vector的彩票克隆效率?
(1) 纯化PCR产物,切胶回收的彩票PCR片段最好。
(2)除去残存的彩票引物等杂质。
(3)DNA片段的彩票立体结构、DNA片段的彩票长短都会娱乐影响克隆效率。一般情况下,大片段DNA的彩票克隆效率(连接效率与转化效率)小于短片段DNA,在使用大片段DNA的彩票连接液进行转化时,建议采用电转化方法。
2. PCR产物难以插入载体,为什么棋牌?
(1)确认PCR反应使用的彩票DNA聚合酶在PCR产物的彩票3'端是注册否附加彩金"A"。有些DNA聚合酶扩增的彩票PCR产物是注册平端,如使用本公司的彩票Pyrobest DNA聚合酶 (TaKaRa Code: DR005)等扩增得到的彩票PCR产物不能直接用于TA克隆;PCR产物保存时间不要过长,长时间保存的彩票PCR产物会娱乐脱去末端的彩票"A"碱基。
(2)PCR产物中短片段杂质DNA太多,这时应切胶回收纯化DNA片段,回收时PCR产物不要在紫外线下暴露时间过长。
(3)确认感受态细胞的彩票转化效率,使用的彩票感受态细胞的彩票转化效率最好大于108 cfu/mg pUC118 DNA。
(4)确认Ligation Solution I 的彩票连接效率是注册否降低,多次反复冻融会娱乐降低的彩票Ligation Solution I 连接效率。
(5)确认抗生素的彩票浓度是注册否过大。
(6)最好使用新配制的彩票平板培养基。
3. 转化后的彩票菌落全为蓝色 (或淡蓝色),为什么棋牌?
插入的彩票PCR片段较短(小于500 bp),且插入片段没有影响lacZ基因的彩票读框时,平板培养基上出现的彩票菌落有可能呈现蓝色。
4. 插入的彩票PCR产物进行测序时,可使用何种引物?
本制品的彩票载体来源于pUC18载体。因此,用于pUC18载体测序的彩票引物都可以使用。
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