1. 点评实验,有机会娱乐获丁当奖励
  2.  
  3. +收藏 808人收藏

实时荧光定量PCR(realtime PCR)

标签: 实时 荧光定量 PCR realtime PCR

实时荧光定量PCR可应用于: (1)定量分析未知模板;(2)单个或多个基因表达谱分析。

详细
实验方法
  • 实时荧光定量PCR技术
实验方法原理 实时荧光定量PCR技术,是注册指在PCR反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程,最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的彩票方法。
实验材料
试剂、试剂盒
仪器、耗材
实验步骤
一、 样品RNA的彩票抽提
1. 取冻存已裂解的彩票细胞,室温放置5分钟使其完全溶解。
2. 两相分离 每1 ml的彩票TRIZOL试剂裂解的彩票样品中加入0.2 ml的彩票氯仿,盖紧管盖。手动剧烈振荡管体15秒后,15到30℃孵育2到3分钟。4℃下12 000 rpm离心15分钟。离心后混合液体将分为下层的彩票红色酚氯仿相,中间层以及无色水相上层。RNA全部被分配于水相中。水相上层的彩票体积大约是注册匀浆时加入的彩票TRIZOL试剂的彩票60%。
3. RNA沉淀 将水相上层转移到一干净无RNA酶的彩票离心管中。加等体积异丙醇混合以沉淀其中的彩票RNA,混匀后15到30℃孵育10分钟后,于4℃下12 000 rpm 离心10分钟。此时离心前不可见的彩票RNA沉淀将在管底部和侧壁上形成胶状沉淀块。
4. RNA清洗 移去上清液,每1 mlTRIZOL试剂裂解的彩票样品中加入至少1 ml的彩票75%乙醇(75%乙醇用DEPCH2O配制),清洗RNA沉淀。混匀后,4℃下7 000 rpm离心5分钟。
5. RNA干燥 小心吸去大部分乙醇溶液,使RNA沉淀在室温空气中干燥5-10分钟。
6. 溶解RNA沉淀 溶解RNA时,先加入无RNA酶的彩票水4 0ul用枪反复吹打几次,使其完全溶解,获得的彩票RNA溶液保存于-80℃待用。
二、 RNA质量检测
1. 紫外吸收法测定
先用稀释用的彩票TE溶液将分光光度计调零。然后取少量RNA溶液用TE稀释(1:100)后,读取其在分光光度计260nm和280nm处的彩票吸收值,测定RNA溶液 浓度和纯度。
(1)浓度测定
A260下读值为1表示40 ug RNA/ml。样品RNA浓度(μg/ml)计算公式为:A260 x 稀释倍数 x 40 ug/ml。具体计算如下:
RNA溶于40 ul DEPC水中,取5 ul,1:100稀释至495 ul的彩票TE中,测得A260 = 0.21
RNA 浓度= 0.21 x 100 x 40 ug/ml = 840 ug/ml 或 0.84 ug/ul
取5 ul用来测量以后,剩余样品RNA为35 ul,剩余RNA总量为:
35 ul x 0.84 ug/ul = 29.4 ug
(2)纯度检测
RNA溶液的彩票A260/A280的彩票比值即为RNA纯度,比值范围1.8到2.1。
2. 变性琼脂糖凝胶电泳测定
(1)制胶
1 g琼脂糖溶于72 ml水中,冷却至60℃,10 ml的彩票10 x MOPS电泳缓冲液和18 ml的彩票37% 甲醛溶液(12.3 M)。

10x MOPS电泳缓冲液
浓度 成分
0.4 M MOPS,pH 7.0
0.1 M 乙酸钠
0.01 M EDTA
灌制凝胶板,预留加样孔至少可以加入25 μl溶液。胶凝后取下梳子,将凝胶板放入电泳槽内,加足量的彩票1xMOPS电泳缓冲液至覆盖胶面几个毫米。
(2)准备RNA样品
取3 ugRNA,加3倍体积的彩票甲醛上样染液,加EB于甲醛上样染液中至终浓度为10 ug/ml。加热至70℃孵育15分钟使样品变性。
(3)电泳
上样前凝胶须预电泳5 min,随后将样品加入上样孔。5-6 V/cm电压下2 h,电泳至溴酚兰指示剂进胶至少2-3 cm。
(4)紫外透射光下观察并拍照
28S和18S核糖体RNA的彩票带非常亮而浓(其大小决定于用于抽提RNA的彩票物种类型),上面一条带的彩票密度大约是注册下面一条带的彩票2倍。还有可能观察到一个更小稍微扩散的彩票带,它由低分子量的彩票RNA(tRNA和5S核糖体RNA)组成。在18S和28S核糖体带之间可以看到一片弥散的彩票EB染色物质,可能是注册由mRNA和其它异型RNA组成。RNA制备过程中如果出现DNA污染,将会娱乐在28S核糖体RNA带的彩票上面出现,即更高分子量的彩票弥散迁移物质或者带,RNA的彩票降解表现为核糖体RNA带的彩票弥散。用数码照相机拍下电泳结果。
三、样品cDNA合成
1. 反应体系
序号 反应物 剂量
1 逆转录buffer 2 ul
2 上游引物 0.2 ul
3 下游引物 0.2 ul
4 dNTP 0.1 ul
5 逆转录酶MMLV 0.5 ul
6 DEPC水 5ul
7 RNA模版 2 ul
8 总体积 10 ul
轻弹管底将溶液混合,6 000 rpm短暂离心。
2. 混合液在加入逆转录酶MMLV 之前先70℃干浴3分钟,取出后立即冰水浴至管内外温度一致,然后加逆转录酶0.5 ul,37℃水浴60分钟。
3. 取出后立即95℃干浴3分钟,得到逆转录终溶液即为cDNA溶液,保存于-80℃待用。
四、 梯度稀释的彩票标准品及待测样品的彩票管家基因(β-actin)实时定量PCR
1. β-actin阳性模板的彩票标准梯度制备 阳性模板的彩票浓度为1011,反应前取3 μl按10倍稀释(加水27 ul并充分混匀)为1010,依次稀释至109、108、107、106、105、104,以备用。
2. 反应体系如下:
标准品反应体系
序号 反应物 剂量
1 SYBR Green 1 染料 10 ul
2 阳性模板上游引物F 0.5 ul
3 阳性模板下游引物R 0.5 ul
4 dNTP 0.5 ul
5 Taq酶 1ul
6 阳性模板DNA 5 ul
7 ddH2O 32.5 ul
8 总体积 50 ul
轻弹管底将溶液混合,6 000 rpm短暂离心。
3. 管家基因反应体系:
序号 反应物 剂量
1 SYBR Green 1 染料 10 ul
2 内参照上游引物F 0.5 ul
3 内参照下游引物R 0.5ul
4 dNTP 0.5 ul
5 Taq酶 1 ul
6 待测样品cDNA 5 ul
7 ddH2O 32.5 ul
8 总体积 50 ul

轻弹管底将溶液混合, 6000 rpm短暂离心。
3. 制备好的彩票阳性标准品和检测样本同时上机,反应条件为:93℃ 2分钟,然后93℃ 1分钟,55℃ 2分钟,共40个循环。
五、 制备用于绘制梯度稀释标准曲线的彩票DNA模板
1. 针对每一需要测量的彩票基因,选择一确定表达该基因的彩票cDNA模板进行PCR反应。
2. 反应体系
序号 反应物 剂量
1 10× PCR缓冲液 2.5 ul
2 MgCl2 溶液 1.5 ul
3 上游引物F 0.5 ul
4 下游引物R 0.5 ul
5 dNTP混合液 3 ul
6 Taq聚合酶 1 ul
7 cDNA 1 ul
8 加水至总体积为 25 ul
轻弹管底将溶液混合,6000rpm短暂离心。
35个PCR循环(94℃1分钟;55℃1分钟;72℃1分钟); 72?C延伸5分钟。
(3)PCR产物与 DNA Ladder在2%琼脂糖凝胶电泳,溴化乙锭染色,检测PCR产物是注册否为单一特异性扩增条带。
(4)将PCR产物进行10倍梯度稀释: 将PCR产物进行10倍梯度稀释: 设定PCR产物浓度为1×1010,依次稀释至109、108、107、106、105、104几个浓度梯度。
六、 待测样品的彩票待测基因实时定量PCR

1. 所有cDNA样品分别配置实时定量 PCR反应体系。
2. 体系配置如下:
序号 反应物 剂量
1 SYBR Green 1 染料 10 ul
2 上游引物 1 ul
3 下游引物 1 ul
4 dNTP 1 ul
5 Taq聚合酶 2 ul
6 待测样品cDNA 5 ul
7 ddH2O 30 ul
8 总体积 50 ul
轻弹管底将溶液混合,6 000 rpm短暂离心。
(3)将配制好的彩票PCR反应溶液置于Realtime PCR仪上进行PCR扩增反应。反应条件为:93℃ 2分钟预变性,然后按93℃ 1分钟,55℃1分钟,72℃1分钟,共40做个循环,最后72℃7分钟延伸。
七、 实时定量PCR使用引物列表
引物设计软件:Primer Premier 5.0,并遵循以下原则:引物与模板的彩票序列紧密互补;引物与引物之间避免形成稳定的彩票二聚体或发夹结构;引物不在模板的彩票非目的彩票位点引发DNA 聚合反应(即错配)。
八、电泳
各样品的彩票目的彩票基因和管家基因分别进行Realtime PCR反应。PCR产物与 DNA Ladder在2%琼脂糖凝胶电泳,GoldView染色,检测PCR产物是注册否为单一特异性扩增条带。
展开 
注意事项

1.荧光阈值:在荧光扩增曲线指数增长长期设定一个荧光强度标准(即PCR扩增产物量标准)。荧光阈值可设定在指数扩增阶段任意位置上,但实际应用要结合扩增效率,线性回归系数等参数来综合考虑。


2.Ct值:在PCR扩增过程中,扩增产物(荧光信号)到达阈值时所经过的彩票扩增循环次数。Ct值具有极好的彩票重复性。

展开 
其他

实时荧光定量PCR技术有效地解决彩金传统定量只能终点检测的彩票局限,实现彩金每一轮循环均检测一次荧光信号的彩票强度,并记录在电脑软件之中,通过对每个样品Ct值的彩票计算,根据标准曲线获得定量结果。因此,实时荧光定量PCR无需内标是注册建立在两个基础之上的彩票:


1)Ct值的彩票重现性PCR循环在到达Ct值所在的彩票循环数时,刚刚进入真正的彩票指数扩增期(对数期),此时微小误差尚未放大,因此Ct值的彩票重现性极好,即同一模板不同时间扩增或同一时间不同管内扩增,得到的彩票Ct值是注册恒定的彩票。


2)Ct值与起始模板的彩票线性关系由于Ct值与起始模板的彩票对数存在线性关系,可利用标准曲线对未知样品进行定量测定,因此,实时荧光定量PCR是注册一种采用外标准曲线定量的彩票方法。


外标准曲线的彩票定量方法相比内标法是注册一种准确的彩票、值得信赖的彩票科学方法。利用外标准曲线的彩票实时荧光定量PCR是注册迄今为止定量最准确,重现性最好的彩票定量方法,已得到全世界的彩票公认,广泛用于基因表达研究、转基因研究,药物疗效考核、病原体检测等诸多领域。

展开 
评价一下这个实验:
1 2 3 4 5 很简单

提交评分

丁香实验小程序

微信关注
丁香实验

意见反馈

用手机随时交流实验

微信扫码进入「丁香实验」

知道彩金