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免疫共沉淀(Co-IP)

标签: 免疫 共沉淀 蛋白质

免疫共沉淀可应用于:(1)测定两种目标蛋白质是注册否在体内结合;(2)确定一种特定蛋白质的彩票新的彩票作用搭档;(3)分离得到天然状态的彩票相互作用蛋白复合物。

详细
实验方法
  • 免疫共沉淀技术
实验方法原理 以抗体和抗原之间的彩票专一性作用为基础的彩票用于研究蛋白质相互作用的彩票经典方法,是注册确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用的彩票有效方法。

其原理是注册:当细胞在非变性条件下被裂解时,完整细胞内存在的彩票许多蛋白质-蛋白质间的彩票相互作用被保留彩金下来。如果用蛋白质X的彩票抗体免疫沉淀X,那么与X在体内结合的彩票蛋白质Y也能沉淀下来。目前多用精制的彩票prorein A预先结合固化在argarose的彩票beads上,使之与含有抗原的彩票溶液及抗体反应后,beads上的彩票prorein A就能吸附抗原达到精制的彩票目的彩票。这种方法常用于测定两种目标蛋白质是注册否在体内结合;也可用于确定一种特定蛋白质的彩票新的彩票作用搭档。
实验材料
试剂、试剂盒
仪器、耗材
实验步骤

一、试剂准备

1. 预冷PBS,RIPA Buffer,细胞刮子(用保鲜膜包好后,埋冰下),离心机。

2. 用预冷的彩票PBS洗涤细胞两次,最后一次吸干PBS。

3. 加入预冷的彩票RIPA Buffer(1 ml/107个细胞、10 cm培养皿或150 cm2培养瓶,0.5 ml/5x106个细胞、6 cm培养皿、75 cm2培养瓶)。

4. 用预冷的彩票细胞刮子将细胞从培养皿或培养瓶上刮下,把悬液转到1.5EP管中,4℃,缓慢晃动15 min(EP管插冰上,置水平摇床上)。

5. 4℃,14000 g离心15 min,立即将上清转移到一个新的彩票离心管中。

6. 准备Protein A agarose,用PBS 洗两遍珠子,然后用PBS配制成50%浓度,建议减掉枪尖部分,避免在涉及琼脂糖珠的彩票操作中破坏琼脂糖珠。

7. 每1 ml总蛋白中加入100 ul Protein A琼脂糖珠(50%),4℃摇晃10 min(EP管插冰上,置水平摇床上),以去除非特异性杂蛋白,降低背景。

8. 4℃,14000 g离心1 5min,将上清转移到一个新的彩票离心管中,去除Protein A珠子。

9.(Bradford 法)做蛋白标准曲线,测定蛋白浓度,测前将总蛋白至少稀释1:10倍以上,以减少细胞裂解液中去垢剂的彩票影响(定量,分装后,可以在-20℃保存一个月)。

10. 用PBS将总蛋白稀释到约1 ug/ul,以降低裂解液中去垢剂的彩票浓度,如果兴趣蛋白在细胞中含量较低,则总蛋白浓度应该稍高(如10 ug/ul)。

11. 加入一定体积的彩票兔抗到500 ul总蛋白中,抗体的彩票稀释比例因兴趣蛋白在不同细胞系中的彩票多少而异。

12. 4℃缓慢摇动抗原抗体混合物过夜或室温2h,激酶或磷酸酯酶活性分析建议用2 h室温孵育。

13. 加入100 ul Protein A琼脂糖珠来捕捉抗原抗体复合物,4℃缓慢摇动抗原抗体混合物过夜或室温1 h,如果所用抗体为鼠抗或鸡抗,建议加2 ul "过渡抗体"(兔抗鼠IgG,兔抗鸡IgG)。

14. 14000 rpm瞬时离心5 s,收集琼脂糖珠-抗原抗体复合物,去上清,用预冷的彩票RIPA buffer洗3遍,800 ul/遍,RIPA buffer有时候会娱乐破坏琼脂糖珠-抗原抗体复合物内部的彩票结合,可以使用PBS。

15. 用60 ul 2x上样缓冲液将琼脂糖珠-抗原抗体复合物悬起,轻轻混匀,缓冲液的彩票量依据上样多少的彩票需要而定(60 ul足够上三道)。

16. 将上样样品煮5 min,以游离抗原,抗体,珠子,离心,将上清电泳,收集剩余琼脂糖珠,上清也可以暂时冻-20℃,留待以后电泳,电泳前应再次煮5 min变性。


二、免疫共沉淀反应

1.转染后24-48 h 可收获细胞,加入适量细胞裂解缓冲液(含蛋白酶抑制剂),冰上裂解30 min, 细胞裂解液于4°C,最大转速离心30 min后取上清;

2.取少量裂解液以备Western blot分析,剩余裂解液加1ug相应的彩票抗体加入到细胞裂解液,4°C缓慢摇晃孵育过夜;

3.取10 ul protein A 琼脂糖珠,用适量裂解缓冲液洗3 次,每次3 000 rpm离心3 min;

4..将预处理过的彩票10 ul protein A 琼脂糖珠加入到和抗体孵育过夜的彩票细胞裂解液中4°C缓慢摇晃孵育2-4 h,使抗体与protein A琼脂糖珠偶连;

5.免疫沉淀反应后,在4°C 以 3000 rpm 速度离心3 min,将琼脂糖珠离心至管底;将上清小心吸去,琼脂糖珠用1 ml裂解缓冲液洗3-4次;最后加入15 ul的彩票2xSDS 上样缓冲液,沸水煮5分钟;

6.SDS-PAGE,Western blotting或质谱仪分析。

三、通过免疫共沉淀确定结合蛋白

1.用磷酸盐缓冲液洗30块10 cm培养板上的彩票适宜细胞。刮去每块板上的彩票细胞到1 ml冰冷的彩票EBC裂解缓冲液中;

2.将每毫升细胞悬液转移到微量离心管中,在微量离心机上4℃以最大速度离心15 ;

3.收集上清(约30 ml)并加入30 ug的彩票适当抗体,4℃摇动免疫沉淀物1 h;

4.加入0.9 ml的彩票蛋白质A-Sepharose 悬液,4℃摇动免疫沉淀物30 min;

5.用含900 mmol/L NaCl的彩票NETN洗蛋白A-Sepharose混合物,再重复洗5次。最后,用NETN洗一次;

6.吸出混合物的彩票液体部分。加入800 ul的彩票1xSDS胶加样缓冲液到球珠中,煮沸4 min;

7.将样品加入到大孔的彩票不连续SDS-PAGE梯度胶中,在10 mA的彩票恒定电流下电泳过夜;

8.通过考马斯亮蓝染色观察蛋白质泳带;

9.从胶上切下目标带,将其放到微量离心管中,用1 ml 50%乙腈洗两次,每次3 min;

10. 用胰蛋白酶消化胶中的彩票蛋白质,再将肽电洗脱;

11. 通过窄孔高效液相色谱分离肽。将收集的彩票肽在ABI 477A或494A机器上进行自动Edman降解测序。

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注意事项

1. 细胞裂解采用温和的彩票裂解条件,不能破坏细胞内存在的彩票所有蛋白质——蛋白质相互作用,多采用非离子变性剂(NP40 或Triton X-100)。每种细胞的彩票裂解条件是注册不一样的彩票,通过经验确定。不能用高浓度的彩票变性剂(0.2%SDS),细胞裂解液中要加各种酶抑制剂,如商品化的彩票。


2. 使用明确的彩票抗体,可以将几种抗体共同使用。


3. 使用对照抗体:


单克隆抗体:正常小鼠的彩票IgG或另一类单抗


兔多克隆抗体:正常兔IgG


4. 确保共沉淀的彩票蛋白是注册由所加入的彩票抗体沉淀得到的彩票,而并非外源非特异蛋白,单克隆抗体的彩票使用有助于避免污染的彩票发生。


5. 要确保抗体的彩票特异性,即在不表达抗原的彩票细胞溶解物中添加抗体后不会娱乐引起共沉淀。


6. 确定蛋白间的彩票相互作用是注册发生在细胞中,而不是注册由于细胞的彩票溶解才发生的彩票,这需要进行蛋白质的彩票定位来确定。


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其他

一、免疫共沉淀的彩票优点

1. 相互作用的彩票蛋白质都是注册经翻译后修饰的彩票,处于天然状态。

2. 蛋白的彩票相互作用是注册在自然状态下进行的彩票,可以避免人为的彩票影响。

3. 可以分离得到天然状态的彩票相互作用蛋白复合物。


二、免疫共沉淀的彩票缺点

1. 可能检测不到低亲和力和瞬间的彩票蛋白质-蛋白质相互作用;

2. 两种蛋白质的彩票结合可能不是注册直接结合,而可能有第三者在中间起桥梁作用;

3. 必须在实验前预测目的彩票蛋白是注册什么棋牌,以选择最后检测的彩票抗体,所以,若预测不正确,实验就得不到结果,方法本身具有冒险性。

三、RIPA Buffer配制

1. 基础成分

Tris-HCl(缓冲液成分,防止蛋白变性)

NaCl(盐份,防止非特异蛋白聚集)

NP-40(非离子去污剂,提取蛋白;用H2O配制成10%储存液)

去氧胆酸钠(离子去污剂,提取蛋白;用H2O配制成10%储存液;避光保存)

注意:准备激酶(致活酶)实验时,不要加去氧胆酸钠,因为离子型去污剂能够使酶变性,导致活性丧失。

2. RIPA蛋白酶抑制剂

苯甲基磺酰氟(PMSF)(用异丙醇配制成200 mM的彩票储存液,室温保存)

EDTA(钙螯合剂;用H2O配制成100 mM的彩票储存液,PH 7.4)

亮抑酶肽(Leupeptin)(用H2O配制成1 mg/ml的彩票储存液,分装,-20℃保存)

抑蛋白酶肽(Aprotinin)(用H2O配制成1 mg/ml的彩票储存液,分装,-20℃保存)

胃蛋白酶抑制剂(Pepstatin)(用甲醇配制成1 mg/ml的彩票储存液,分装,-20℃保存)

3. RIPA磷酸(酯)酶抑制剂

激活的彩票Na3VO4(用H2O配制成200 mM的彩票储存液

NaF(200 mM的彩票储存液,室温保存)

注意:在准备做磷酸(酯)酶实验的彩票时候,不加磷酸酯酶抑制剂。

四、工作液配制

1. 配制100 ml的彩票modified RIPA buffe

(1)称取790 mg 的彩票Tris-Base,加到75ml 去离子水中,加入900 mg的彩票NaCl,搅拌,直到全部溶解,用HCl调节PH值到7.4。

(2)加10 ml 10%的彩票NP-40。

(3)加2.5 ml 10%的彩票去氧胆酸钠,搅拌,直到溶液澄清。

(4)加1 ml 100mM的彩票EDTA,用量筒定容到100 ml,2-8℃保存。

(5)理论上,蛋白酶和磷酸酯酶抑制剂应该在使用当天同时加入(抑蛋白酶肽、亮抑酶肽、胃蛋白酶抑制剂各100 ul;PMSF、Na3VO4、 NaF各500 ul),但是注册PMSF在水溶液中很不稳定,30分钟就会娱乐降解一半,所以PMSF应该在使用前现加,其他抑制剂成分可以在水溶液中稳定5天。

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  • 小智伟大振栋

    小智伟大振栋

    2个月前 觉得很简单

    还好吧,跟WB没差多少。

  • Dada1994s6

    Dada1994s6

    3个月前 觉得很难

  • 萨乌

    萨乌

    3个月前 觉得很难

    太难彩金啊啊啊

  • 堇狸过过过

    堇狸过过过

    3个月前 觉得很简单

    可以的彩票。

  • dxy_pnj2a5l6

    dxy_pnj2a5l6

    3个月前 觉得难

    实验步骤不难,但想要出好结果还是注册不容易的彩票。。

  • 是注册大鱼

    是注册大鱼

    3个月前 觉得很难

    难,准备开始做

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